|
|
Dvousložkový signalizační systém bakterií využívající analogy hemu
Bečková, Alexandra ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Prošková, Veronika (oponent)
5 Abstrakt Hemoproteiny jsou esenciální součástí jak prokaryontních, tak eukaryotních organizmů, kde hrají roli při naplňování mnoha významných životních funkcí. Dle funkce je možné hemoproteiny rozdělit do několika typů. Konkrétní typ proteinů, který byl i objektem zájmu téhle bakalářské práce jsou senzorové hemoproteiny. Funkce části těchto senzorových hemoproteinů spočívá v schopnosti detekce diatomických molekul plynů a jejich následném navázaní na molekulu hemu v daném hemoproteinu, čímž se změní vlastnosti taky senzorového hemoproteinu a následně se signál stává součástí signalizačních drah. Příkladem senzorového hemoproteinu je histidinkinasa s globinovou strukturou senzorové domény z Anaeromyxobacter sp. Fw 109 (AfGcHK), s kterou se během experimentální části bakalářské práce pracovalo. Nejprve byla provedena transformace E. coli BL-21 (DE3) buněk plazmidem pET21c(+)/AfGcHK, následná kultivace buněk a exprese AfGcHK proteinu v buňkách. Exprimovaný AfGcHK protein byl izolován ve dvou formách. Jedna forma představovala AfGcHK protein s obsahem hemu, tedy se zabudovaným železem ve své struktuře. Druhá forma představovala AfGcHK protein s obsahem analogu hemu, který měl ve své struktuře místo železa zabudován nikl. Protein s obsahem hemu byl izolován s výtěžkem 3,98 mg/l TB média a protein s obsahem...
|
|
|
Detailní enzymová charakterizace modelového zástupce hemových kyslíkových senzorů
Vojáčková, Lukrécie Sophie ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
Tato práce je zaměřena na hemové senzorové proteiny detekující kyslík, zejména na fosfodiesterasu z bakterie Escherichia coli, označovanou jako EcDOS. Tento enzym katalyzuje degradaci c-di-GMP, což je důležitá signální molekula bakterií, jež má vliv na určité buněčné pochody, např. na pohyblivost bakterií nebo tvorbu biofilmů. Práce se zabývá detailní enzymovou kinetikou forem proteinu v různých redoxních a ligandových stavech iontu železa hemu [Fe(III), Fe(II) a Fe(II)-O2] a věnuje se také mutantní formě tohoto enzymu (EcDOS H77A), která neváže hem. Jedním z výsledků práce bylo potvrzení toho, že forma EcDOS WT Fe(II)-O2 vykazuje vyšší hodnoty kcat než forma EcDOS s iontem železa hemu v redukovaném stavu. Překvapením bylo zjištění, že aktivita enzymu je ovlivněna nejen stavem iontu železa hemu, ale i přítomnými dvojmocnými kationty kovů a jejich koncentracemi. Přítomnost kationtu kovu je pro funkci enzymu esenciální a vhodnými ionty kovů, které stimulují enzymovou aktivitu, jsou Mg2+ , Mn2+ a Zn2+ nebo jejich směsi, jež působí na aktivitu enzymu za zvolených podmínek synergicky. Analýza pomocí ICP-MS také prokázala, že kationty Zn2+ jsou přirozenou součástí enzymu. Tudíž by pro další kinetické studie bylo vhodné využít Zn2+ nebo směsi iontů kovů, které jsou fyziologické pro E. coli, z níž EcDOS...
|
|
|
Studium struktury a funkce modelových hemových proteinů
Lengálová, Alžběta ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent) ; Muchová, Lucie (oponent)
Hem je jedním z nejdůležitějších a nejlépe prostudovaných kofaktorů potřebných pro správné fungování mnoha proteinů. Proteiny obsahující hem tvoří obrovskou skupinu biologicky významných molekul, které se účastní mnoha fyziologických procesů. Předkládaná disertační práce se věnuje dvěma skupinám hemových senzorových proteinů, a to prokaryotickým hemovým senzorům plynných molekul a eukaryotickým senzorům detekujících hem. Hemové senzory, které detekují plynné molekuly, hrají důležitou roli v regulaci mnoha bakteriálních procesů a jsou obvykle tvořeny dvěma doménami, doménou senzorovou a doménou funkční. Disertační práce se zaměřuje na studium dvou zástupců ze skupiny bakteriálních senzorů detekujících plyny, histidinkinasy AfGcHK a diguanylátcyklasy YddV. Hlavním cílem práce bylo objasnit mechanismus mezidoménového přenosu signálu u těchto dvou modelových hemových senzorů. Za pomoci rentgenové krystalografie a metody vodík-deuteriové výměny v kombinaci s hmotnostní spektrometrií byly odhaleny významné rozdíly ve struktuře proteinu AfGcHK při přechodu z jeho aktivní na neaktivní formu. Příjem určitého signálu senzorovou doménou AfGcHK ovlivní strukturní vlastnosti proteinu, a tyto konformační změny mají pak nepřímo vliv na enzymovou aktivitu domény funkční. Disertační práce se dále detailněji věnuje...
|
|
|
Studium vlivu analogů hemu na strukturně-funkční charakteristiku modelového zástupce hemových senzorových proteinů
Ďatko, Peter ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Vávra, Jakub (oponent)
Hemové senzorové proteiny umožňují bakteriálním buňkám reagovat na změnu koncentrace látek v jejich okolí. Tato odpověď závisí na vazbě ligandu na atom železa, koordinovaného v molekule hemu. Modelem tohoto signálního systému je histidinkinasa s globinovou strukturou senzorové domény, AfGcHK. Hlavním cílem této bakalářské práce byla příprava a základní charakterizace formy AfGcHK, která místo hemu obsahuje komplex protoporfyrinu s manganem. Pro expresi proteinu byla využita transformace buněk E. coli BL- 21 (DE3) plamidem pET21c(+)/AfGcHK. Protein byl izolován a purifikován pomocí afinitní chromatografie a gelové chromatografie. Pro zjištění enzymové aktivity byla použita elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v prostředí dodecylsíranu sodného s přídavkem Phos-tagu. Bylo zjištěno, že připravená unikátní forma AfGcHK je enzymově aktivní. Dále provedená spektrální analýza prokázala, že forma AfGcHK obsahující komplex protoporfyrinu s manganem je citlivá k redukci dithioničitanem sodným. Klíčová slova: hem, hemové senzorové proteiny, kyslíkový senzor, přenos signálu
|
|
|
Biochemická charakterizace modelového zástupce hemových senzorových proteinů obsahujícího analog hemu
Hlubučková, Darina ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Prošková, Veronika (oponent)
Nedílnou součástí života buněk je buněčná signalizace, která je zajištěna mimo jiné hemovými proteiny, konkrétně jejich skupinou s názvem hemové senzorové proteiny. Hemové senzorové proteiny se dělí do dvou skupin, hemové senzorové proteiny detekující hem, které se vyskytují spíše v eukaryotních buňkách a hemové senzorové proteiny detekující plynné molekuly, které jsou typické spíše pro prokaryotní buňky. Plynnými molekulami mohou být v tomto případě CO, NO a O2. Skupina hemových senzorových proteinů detekujících kyslík má kruciální význam pro bakterie, které se musí přizpůsobovat proměnlivé koncentraci kyslíku v okolním prostředí. Jednou z těchto bakterií je půdní bakterie Anaeromyxobacter sp., kmen Fw 109-5, která obsahuje hemový senzorový protein s globinovou strukturou senzorové domény a histidinkinasovou aktivitou domény funkční (AfGcHK), umožňující bakteriím kromě jiného například tvorbu biofilmu.. . V rámci teoretické části této práce byly shrnuty dosavadní poznatky o hemových senzorových proteinech se zaměřením na protein AfGcHK. V praktické části této bakalářské práce byly transformovány bakteriální buňky E. coli BL-21 (DE3) plazmidem pET21(+)/AfGcHK obsahujícím gen kódující AfGcHK, ze kterých byly následně izolovány dvě formy AfGcHK, přirozená forma a forma obsahující analog hemu,...
|
|
|
Molecular logic of the Notch ligands in development and disease
Trampotová, Eliška ; Mašek, Jan (vedoucí práce) ; Rozbeský, Daniel (oponent)
Signální dráha Notch je jednou z klíčových forem transdukce signálu v embryonálním vývoji všech metazoa. U savců se kanonické signalizace na čtyřech Notch receptorech účastní pět ligandů lišících se mezi sebou svou strukturou i funkcí. Zásadní význam této signalizační dráhy v embryonálním vývoji odráží vrozené vady způsobené mutacemi receptorů či ligandů. Ukázkovým příkladem takovéto vrozené poruchy je Alagillův syndrom - vzácné multisystémové onemocnění způsobené v 94 % případů mutacemi Notch ligandu Jagged1. Podstatná část dosavadního výzkumu byla směřována k Notch receptorům za účelem osvětlení jejich funkcí, nicméně je nasnadě tvrdit, že regulace aktivity dráhy ligandy může mít v signalizaci dokonce větší význam. Tato práce si proto klade za cíl komplexní srovnání pěti savčích ligandů dráhy Notch, jejich struktur a funkcí ve vývojových procesech. Práce se zaměřuje na variabilitu interakcí ligand-receptor a biofyzikální mechanismy signalizace, přičemž zdůrazňuje význam intracelulárních domén Notch ligandů v těchto interakcích.
|
|
|
Strukturní charakterizace modelového zástupce hemových kyslíkových senzorů
Tajovská, Eva ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Jednou z podskupin hemoproteinů jsou hemové senzory plynů, které jsou schopny detekovat dvouatomové plynné molekuly ve svém bezprostředním okolí. Po navázání molekuly plynu na atom železa hemu v senzorové doméně těchto proteinů nebo naopak po její disociaci z tohoto atomu dochází k přenosu signálu ze senzorové domény do domény funkční a následně k regulaci důležitých buněčných funkcí. Pochopení mechanismu působení těchto senzorů je klíčové pro případné ovlivnění jejich funkce. Taková znalost by pak následně umožnila využití senzorů plynů jako terapeutických cílů pro vývoj antibiotik nové generace, pokud vezmeme v úvahu jejich přítomnost v patologických bakteriích. Předkládaná diplomová práce se zabývá modelovým zástupcem senzorových hemoproteinů detekujících plyny, kyslíkovým senzorem EcDOS z E. coli, a jeho apoformou, EcDOS His77Ala. Oba proteiny byly připraveny rekombinantní expresí a purifikací a následně spektrofotometricky charakterizovány. Pomocí gelové permeační chromatografie byl stanoven oligomerní stav EcDOS Fe(III), EcDOS Fe(II)-O2 a EcDOS His77Ala za různých podmínek (různé způsoby temperování preparátu, přítomnost substrátu c-di-GMP atd.). Dále byla studována strukturní dynamika EcDOS Fe(III), EcDOS Fe(II)-O2 a EcDOS His77Ala pomocí metody HDX-MS. Klíčová slova: hem, hemové senzorové...
|
|
|
New leukocyte membrane adaptor proteins
Králová, Jarmila ; Brdička, Tomáš (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Šedivá, Anna (oponent)
Membránové adaptorové proteiny nemají samy o sobě žádnou enzymatickou aktivitou. Je však pro ně typická přítomnost různých interakčních domén umožňujících vazbu na další proteiny a buněčné membrány. Jejich funkcí je spojovat receptory nebo jiné adaptory s proximálními signalizačními molekulami. Zda jejich vliv na přenos signálu bude aktivační nebo inhibiční závisí zejména na povaze efektorových molekul, které váží. Jedním z membránových adaptorových proteinů, kterými se zabývá tato práce je adaptor SCIMP. Je exprimován v buňkách prezentujících antigen a zesiluje signalizaci MHCII v B buňkách. Tato dizertační práce se zabývá analýzou funkce proteinu SCIMP v primárních myších B lymfocytech a v dalších buňkách prezentujících antigen. Její hlavní součástí je podrobná analýza SCIMP deficientních myší. I přesto, že změny v zastoupení imunitních buněčných populací u SCIMP deficientních myší nebyly signifikantní, podařilo se nám najít funkci proteinu SCIMP v dendritickách buňkách, kde se uplatňuje jako signalizační adaptor v dráze receptoru DECTIN-1 důležitého pro antifungální imunitu. Data prezentovaná v této práci popisují signalizaci zprostředkovanou adaptorem SCIMP v pozdních časových bodech aktivace receptoru DECTIN-1, která je také důležitá pro produkci anti-fungálních cytokinů. Dalším zajímavým...
|
|
|
Involvement of Asthma-associated Protein ORMLDL3 in Mast Cell Signalling
Eitler, Jiří ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent)
5 Abstrakt Žírné buňky působí v mnoha imunologických procesech, avšak nejvíce jsou známy v kontextu alergie a astmatu. Jelikož astma a alergie jsou závažné choroby s rozšiřující se tendencí v posledních desetiletích, žírné buňky jsou předmětem intenzivního výzkumu. Studium signálních drah v žírných buňkách může přispět k pochopení vzniku těchto chorob a navržení účinných léčebných strategií. Hledání genů zodpovědných za astma je v současné době umocněno širokospektrými genomovými studiemi. ORMDL3 (Orosomucoid1-like) protein byl pomocí těchto metod rozpoznán jako velmi významný faktor zodpovědný za astma. ORMDL3 je členem evolučně konzervované rodiny ORMDL, která u savců zahrnuje také ORMDL2 a ORMDL1 proteiny. Role těchto proteinů v buněčných procesech je málo známa, navíc doposud nebyly studovány v žírných buňkách. Rozhodli jsme se tedy studovat ORMDL proteiny v žírných buňkách. Lentivirový systém byl zoptimalizován k produkci primárních žírných buněk se sníženou expresí proteinů ORMDL, tzv. ORMDL KD (z angl. knock-down). Exprese ORMDL genů byla měřena s použitím vylepšené qPCR (quantitative PCR) směsi. Všechny tři geny jsou v žírných buňkách exprimovány, přičemž nejvíce ORMDL3, pak ORMDL2 a ORMDL1. Zkoumali jsme vliv ORMDL proteinů na signalizaci v žírných buňkách. ORMDL3 KD vykazoval sníženou degranulaci...
|
|
|
Porovnání vlastností transkripčního faktoru "Bach1" v jeho apoformě a holoformě
Vávra, Jakub
Hemoproteiny představují vzhledem k jejich širokému výskytu a rozmanitým funkcím nepostradatelnou součást mnoha živých organismů. Mezi typické funkce hemoproteinů patří participace na transportu a uskladnění kyslíku v živých organismech, transport elektronů v rámci dýchacího řetězce či enzymová katalýza reakcí, kterých se účastní kyslík, případně peroxid vodíku. Poměrně nedávno byla objevena nová skupina hemoproteinů, jejíž zástupci disponují schopností detekovat buď změny koncentrace hemu (senzorové proteiny, které detekují hem), nebo změny koncentrace dvouatomových molekul plynů (hemové senzorové proteiny, které detekují plyny) v jejich okolním prostředí. Signály generované v rámci této detekce způsobují strukturní změny příslušných senzorových proteinů a ovlivňují tak jejich funkce. Předmětem této diplomové práce je příprava a následná charakterizace eukaryotického senzorového proteinu Bach1, který detekuje hem. Důraz je kladen především na interakční schopnosti proteinu Bach1 s heminem a komparaci vlastností apoformy a holoformy Bach1. Pozornost je věnována hlavně počtu molekul heminu, které jsou schopny specificky interagovat s Bach1, a to za různých podmínek (odlišný redoxní stav iontu železa v hemu, přítomnost interakčních partnerů Bach1 apod.). Součástí této práce je také analýza vlivu...
|
host ::
RSS.